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A tecnica de transferencia nuclear e uma ferramenta que possibilita a producao de embrioes clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiologicos durante o desenvolvimento embrionario. Este trabalho teve como objetivos a otimizacao da tecnica de clonagem no Laboratorio de Embriologia e Biotecnicas de Reproducao (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespecie, e testar a eficiencia da utilizacao de oocitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrucao dos embrioes clones, sendo realizado em tres etapas. A primeira teve por objetivo o  estabelecimento da tecnica de clonagem, bem como sua otimizacao nas nossas condicoes, dando condicoes para que os experimentos subsequentes pudessem ser realizados. Para isto, foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulacao, sistemas de ativacao quimica, meios de cultivo e fontes proteicas no cultivo dos embrioes, e celulas oriundas de diferentes origens e animais como doadores de nucleo. Os resultados obtidos in vitro alcancaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embrioes foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a producao de clones interespecies utilizando o citoplasma bovino como receptor para celulas ovinas, caprinas e suinas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suina (57,1%) nao diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embrioes NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes as taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embrioes chegaram ao estadio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suino nao houve desenvolvimento ate o estadio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilizacao de oocitos vitrificados imaturos, com citoplasma receptor, foram realizados. Foram submetidos a maturacao 764 complexos cumuli-oocitos vitrificados, e 73% destes foram recuperados apos o desnudamento, e 46,8% apresentavam corpusculo polar, taxas significativamente inferiores as observadas nos oocitos nao-vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivencia apos a micromanipulacao (77,8%), taxa de fusao (82,1%) e de sobrevivencia apos a ativacao (79,9%) do grupo vitrificado, nao apresentaram diferenca significativa com o grupo controle nao-vitrificado. As taxas de blastocistos tambem nao apresentaram diferenca entre os grupos vitrificado e nao-vitrificado (16,7% e 23,4%), respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oocitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condicoes estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embrioes clones bovinos ate o estadio de blastocisto ou a termo, e proporcionaram citoplasmas compativeis para o desenvolvimento de embrioes clones interespecie ate o estadio de blastocito.

acta scientiae veterinariae

Otimização do sistema de produção de clones por transferência nuclear com a itilização de oócitos vitrificados e diferentes tipos celulares como doadores de núcleo