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Bladder cancer is an urogenital cancer affecting men and women, and just in Brazil 8,600 new cases are diagnosed annually. Transurethral cystoscopy is a standard conduct in the diagnosis and monitoring of bladder cancer. However, this procedure is extremely invasive, painful, expensive and does not guarantee the best results. Thus, the searching for molecular markers may assist in the diagnosis and monitoring of bladder cancer, as well as decreasing the need for invasive tests in the monitoring of patients treatment. In this way, urine shows an important role as a source of biomarkers, mainly due to its non-invasive nature. In this work we used two 'omics' approaches: proteomics and metabolomics, to search for biomarkers in urine for the diagnosis and progression of bladder cancer, respectively. The proteomics approach was explored for biomarkers for diagnosing disease. Using 2-DE, OFFGEL electrophoresis, and MS techniques, as well multivariate statistical analysis, they were identified 32 proteins that may be pointed as potential markers for bladder cancer. The metabolomics approach was used to search for biomarkers for progression and recurrence of the disease. The analytical techniques used for this approach, LC-MS and CE-MS, were complementary to each other and the results evaluated with multivariate statistical analysis indicated that 19 metabolites for recurrence and 23 metabolites for progression of bladder cancer could possibly be used for validation studies. Thus, we demonstrated how the 'omics' sciences, which include highthroughput analytical techniques, multivariate statistical analysis, and bioinformatics tools, aid in the discovery of potential biomarkers for noninvasive diagnosis, evaluate recurrence and monitor progression of bladder cancer. Therefore, this study was of high relevance to demonstrate the potential of such techniques to contribute to studies of personalized medicine. Lista de Ilustrações Capítulo 1 Câncer de Bexiga, Biomarcadores e Ciências ‘Ômicas’ Figura 1.1 Diagrama do estadiamento do câncer de bexiga. 3 Figura 1.2 Exame de cistoscopia transuretral para diagnostico de câncer de bexiga. 4 Figura 1.3 Formação da urina pelos rins. 10 Figura 1.4 Evolução no número de artigos indexados publicados na última década. 11 Figura 1.5 Representação do processo de ionização por electrospray. 16 Figura 1.6 Representação do processo de ionização por MALDI. 17 Figura 1.7 Score plot da urina de pacientes com câncer de bexiga de (●) alto e (●) baixo risco construídos com PCA, PLS-DA e OPLS-DA. 22 Capítulo 2 Análise Proteômica Figura 2.1 Esquema ilustrativo das etapas da eletroforese 2-DE. 26 Figura 2.2 (A) Equipamento OFFGEL (Agilent Tecnhologies) e (B) esquema do seu processo de fracionamento das proteínas. 28 Figura 2.3 Perfil eletroforético do pool de amostras de indivíduos controle obtidos por diferentes métodos de extração utilizando as condições eletroforéticas descritas no item 3.3. 42 Figura 2.4 Géis de 2-DE do pool de amostras de indivíduos controle obtidos com precipitação com (A) acetona e (B) etanol, utilizando 150 μg de proteínas e condições eletroforéticas descritas no item 3.3. 42 Figura 2.5 Comparação do mesmo gel do pool de indivíduos controle precipitadas com acetona e corado com (A) Coomassie Blue e (B) nitrato de prata, utilizando 150 μg de proteínas e condições eletroforéticas descritas no item 3.3. 44 Figura 2.6 Gel 1-DE para o pool de amostras de indivíduos controle antes e após a remoção da albumina e da fração retida na coluna, utilizando as condições eletroforéticas descritas no item 3.3. 45 Figura 2.7 Géis 2-DE do pool de indivíduos (A) antes, (B) após a remoção da albumina e (C) da fração retida na coluna, utilizando 150 μg de proteínas e condições eletroforéticas descritas no item 3.3. 46 Figura 2.8 Gel 1-DE para comparação de pool de amostras de indivíduos controle, pacientes com câncer de bexiga sem diluição e pacientes com câncer de bexiga com diluição de 20 vezes. As condições eletroforéticas utilizadas foram descritas no item 3.3. 48 Figura 2.9 Géis de eletroforese 2-DE do pool de amostras de (A) indivíduos controle e (B) pacientes com câncer de bexiga utilizando 150 μg de proteínas e condições eletroforéticas descritas no item 3.3. 49 Figura 2.10 (A) Score e (B) loading plot do modelo construído com PCA a partir dos dados obtidos por eletroforese 2-DE para comparação de indivíduos controle (●C) e doentes com câncer de bexiga (●D). R 2 = 0,983; Q 2 = 0,960. ● Variáveis de ambas as classes. 50 Figura 2.11 Cromatogramas das frações (A) CF5 (controle fração 5) e (B) D5 (doente fração 5) após focalização no OFFGEL. As condições cromatográficas utilizadas foram descritas no item 3.8. 51 Figura 2.12 (A) Score e (B) loading plot do modelo construído com PCA a partir dos dados obtidos por OFFGEL e LC-MS para comparação das frações de indivíduos controle (●CF) e doentes com câncer de bexiga (●DF). R 2 = 0,997; Q 2 = 0,513. ● Variáveis de ambas as classes. 52 Figura 2.13 Esquema de ativação da via reguladora anti-apoptótica (via Akt). 63 Figura 2.14 Esquema de inibição da proteína pró-apoptótica TNFA pela fetuína A e TNR14. 65 Capítulo 3 Análise Metabolômica Figura 3.1 Perfil de todas as amostras obtidas com A) LC-MS e B) CE-MS antes do alinhamento 83 Figura 3.2 Modelos construídos com PCA a partir dos dados obtidos com (A) LC-MS e (B) CE-MS. QC, EB, RB, EA, RA. 84 Figura 3.3 Modelos construídos com PLS-DA a partir dos dados obtidos com (A) LC-MS e (B) CE-MS. QC, EB, RB, EA, RA. 86 Figura 3.4 Modelos construídos com OPLS-DA a partir dos dados obtidos com LC-MS para as seguintes comparações: (A) EB vs. RB; (B) EA vs. RA; (C) EB vs. EA; (D) RB vs. RA. QC, EB, RB, EA, RA. A: R 2 = 1,000, Q 2 = 0,448; B: R 2 = 1,000, Q 2 = 0,607; C: R 2 = 1,000, Q 2 = 0,414; D: R 2 = 1,000, Q 2 = 0,744. 87 Figura 3.5 Modelos construídos com OPLS-DA a partir dos dados obtidos com CE-MS para as seguintes comparações: (A) EB vs. RB; (B) EA vs. RA; (C) EB vs. EA; (D) RB vs. RA. QC, EB, RB, EA, RA. A: R 2 = 0,867, Q 2 = 0,242; B: R 2 = 0,974, Q 2 = 0,449; C: R 2 = 1,000, Q 2 = 0,572; D: R 2 = 0,971, Q 2 = 0,402. 88 Figura 3.6 Esquema simbolizando parte do metabolismo da tirosina, com destaque para formação de tirosina e dopaquinona pela enzima tirosinase. 94 Figura 3.7 Esquema simbolizando parte do metabolismo da purina, com destaque para os metabólitos hipoxantina e ácido úrico e atuação da xantina oxiredutase. 96 -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] Colored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] C lored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] Colored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] Colored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) tP S [2 ] t P S [ 1 ] r a w d a t a Q C S n o v a _ S I M C A . M 5 ( P C A X ) , P C A Q C S P R E D I C T I O N , P S r a w d a t a Q C S n o v a _ S I M C A t P S [ C o m p . 1 ] / t P S [ C o m p . 2 ] C o l o r e d a c c o r d i n g t o c l a s s e s i n M 5 R 2 X [ 1 ] = 0 , 0 5 8 9 2 8 8 R 2 X [ 2 ] = 0 , 0 4 1 2 9 E l l i p s e : H o t e l l i n g T 2 ( 0 , 9 5 ) N o C l a s s 1 2 3 4 S I M C A P + 1 2 . 0 . : 3 3 : 0 3 ( U T C + 1 ) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] Colored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] C lored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] Colored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) -90 -60 -30 0 30 60 90 -120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 tP S [2 ] tPS[1] raw data QCS nova_SIMCA.M5 (PCA-X), PCA QCS PREDICTION, PS-raw data QCS nova_SIMCA tPS[Comp. 1]/tPS[Comp. 2] Colored according to classes in M5 R2X[1] = 0,0589288 R2X[2] = 0,04129 Ellipse: Hotelling T2 (0,95) No Class 1 2 3 4 SIMCA-P+ 12.0.1 2012-12-17 16:33:03 (UTC+1) tP S [2 ] t P S [ 1 ] r a w d a t a Q C S n o v a _ S I M C A . M 5 ( P C A X ) , P C A Q C S P R E D I C T I O N , P S r a w d a t a Q C S n o v a _ S I M C A t P S [ C o m p . 1 ] / t P S [ C o m p . 2 ] C o l o r e

Avaliação analítica de potenciais biomarcadores para câncer de bexiga em urina